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小鼠骨髓的染色體制備方法步驟

更新時(shí)間:2019-11-15   點(diǎn)擊次數(shù):4367次

    染色體制備方法步驟

    (1)秋水仙素處理:取骨髓前3h先給小鼠腹腔注入秋水仙素,注射劑量為100μg/kg動(dòng)物體重。

    (2)取骨髓:用損傷脊髓法處死小鼠,然后用剪刀剪開大腿上的皮膚和肌肉,取出大腿骨,用一小塊紗布搓干凈附在骨上的肌肉碎渣。剪掉股骨兩端膨大的關(guān)節(jié)頭,然后用注射器吸取5ml 0.85%生理鹽水,插入股骨一端,將骨髓細(xì)胞沖洗至10ml的離心管中??芍貜?fù)沖洗多次,直至骨髓腔呈白色為止。

    (3)低滲處理:將所獲得的細(xì)胞懸浮液以 1000rpm離心10min,吸去上清液,留0.2ml沉淀物,加0.075mol/L KCL 溶液(37℃)至8ml刻度,將細(xì)胞沉淀物吹散打勻,在37℃水浴低滲25min。

    (4)固定:低滲處理后,立即加入1ml新配制且預(yù)冷的固定液,抽打均勻,然后1000 rpm離心10min,棄上清。沿管壁加固定液至6ml, 吹散細(xì)胞后靜止固定10min,即*次固定。按上述條件離心,去上清液,再次加入固定液至6ml,進(jìn)行第二次固定。10min后離心吸去上清液,留0.2ml沉淀物,再往沉淀物中滴加4滴固定液,沖勻制成細(xì)胞懸液。

    (5)滴片:取事先在冰箱中預(yù)冷的載玻片,從約15cm高處向每個(gè)載玻片上滴1~2滴細(xì)胞懸液于粘有冰水的載玻片上,晾干。

    (6)染色:取制片平放在玻璃板上,用1∶9 Giemsa染液染色20min,流水沖洗后晾干。

    (7)觀察:小白鼠染色體的形態(tài)特征,并計(jì)算2n的染色體數(shù)目。

    實(shí)驗(yàn)原理 小鼠骨髓細(xì)胞有高度的分裂活性,并且數(shù)量非常多,因此不必進(jìn)行體外培養(yǎng),可直接觀察到分裂期細(xì)胞。處于分裂期的細(xì)胞經(jīng)秋水仙素處理,阻斷紡錘絲的形成,使細(xì)胞分裂停止于中期,此時(shí)染色體達(dá)到zui大收縮,具有典型的形態(tài)。低滲處理使細(xì)胞破裂,便于染色體分散。該方法在臨床上多用于白血病的研究,也可用于觀察毒性物質(zhì)對(duì)機(jī)體遺傳物質(zhì)——染色體損傷的狀況。

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