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ELISA試劑預(yù)防非特異性染色

更新時(shí)間:2019-12-26   點(diǎn)擊次數(shù):933次

    非特異染色的原因包括一抗和二抗與血清蛋白的相互作用,抗體與組織之間的離子相互作用,以及與能夠影響IHC檢測(cè)系統(tǒng)的內(nèi)源分子的相互作用。這些問(wèn)題會(huì)產(chǎn)生高背景,以及無(wú)法在適當(dāng)?shù)募?xì)胞位置觀察目的抗原。這種類型的染色問(wèn)題可通過(guò)用封閉劑來(lái)封閉非特異相互作用來(lái)解決。在將樣本與一抗共同孵育之前,可開展這些步驟

    預(yù)防非特異疏水相互作用

    盡管疏水相互作用在抗原表位-抗體的結(jié)合中起了重要作用,但這些力同樣能促進(jìn)非特異結(jié)合。由于一些氨基酸的中性側(cè)鏈,大部分蛋白有著某種程度的疏水性。將組織與熱滅活的正常血清或牛血清白蛋白(BSA)共同孵育,是降低非特異疏水結(jié)合的常用步驟。正常血清類型的選擇對(duì)預(yù)防與一抗或二抗的相互作用,或預(yù)防與待染色組織/細(xì)胞的相互作用很重要。例如,在使用山羊來(lái)源的一抗時(shí),不建議用山羊血清作為封閉劑。而是推薦與二抗的宿主動(dòng)物相同的血清或來(lái)自不相關(guān)物種的血清。BSA和脫脂奶粉常用作封閉劑。這些試劑通常包含在一抗和二抗的稀釋液中。非離子去污劑如0.3% Triton X-100?或Tween 20?的添加也能降低非特異疏水相互作用。

    預(yù)防非特異離子相互作用

    如果使用的抗體與目的組織有著相反的凈電荷,那么離子相互作用可能導(dǎo)致非特異的背景染色。例如,非特異染色可能來(lái)自相反的羧基和氨基相互作用。范德華力、兩級(jí)分子間的弱靜電相互作用也能起作用。增加固定劑和/或抗體稀釋液的離子強(qiáng)度能降低離子相互作用。不過(guò),表位-抗體結(jié)合通常依賴于離子強(qiáng)度,因此這種方法也可能負(fù)面影響染色特異性。由于單克隆抗體的單表位特異性,與多克隆抗體相比,增加離子強(qiáng)度更可能損害其性能。

    內(nèi)源酶的干擾

    顯色檢測(cè)法常使用一種結(jié)合的酶來(lái)觀察表位-抗體的相互作用。在使用這種檢測(cè)方法時(shí),同一種酶的內(nèi)源活性必須被封閉。例如,包含辣根過(guò)氧化物酶(HRP)或堿性磷酸酶(AP)的操作步驟可能需要試劑來(lái)防止非特異信號(hào)。腎、肝或帶有紅細(xì)胞的血管區(qū)域等組織含有內(nèi)源的過(guò)氧化物酶活性。由3-10% H2O2配制而成的過(guò)氧化物酶封閉液能用于防止內(nèi)源的過(guò)氧化物酶切割底物。

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