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酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)實(shí)驗(yàn)操作步驟

更新時(shí)間:2020-12-09   點(diǎn)擊次數(shù):5970次

一、實(shí)驗(yàn)方法原理
本法首先也是用特異性抗體包被于固相載體,經(jīng)洗滌后加入含有抗原之待測(cè)樣品,如待檢樣品中有相應(yīng)抗原存在,即可與包被于固相載體上的特異性抗體結(jié)合,經(jīng)保溫孵育洗滌后,即可加入酶標(biāo)記特異性抗體,再經(jīng)孵育洗滌后,加底物顯色進(jìn)行測(cè)定,底物降解的量即為欲測(cè)抗原的量。
 
這種方法欲測(cè)的抗原必須有兩個(gè)可以與抗體結(jié)合的部位,因?yàn)槠湟欢艘挥诠滔噍d體上的抗體作用,而另一端則要與酶標(biāo)記特異性抗體作用。因此,不能用于分子量小于5000的半抗原之類的抗原測(cè)定。我們用在霍亂腸毒素的測(cè)定。HbSAg及HbS的測(cè)定。

二、實(shí)驗(yàn)材料
1.樣本:血清 血漿 體液
2.試劑、試劑盒:碳酸鹽包被緩沖液 抗體球蛋白 吐溫 檸檬酸 硫酸
3.耗材:酶標(biāo)比色計(jì) 96孔板 移液槍 離心管 離心管盒

三、實(shí)驗(yàn)步驟
1.包被抗體:用包被緩沖液稀釋特異性抗體球蛋白至適濃度(1~10 ug /ml),每凹孔加0.3 ml,4℃過夜,或37℃水浴3小時(shí),貯存冰箱。
 
2.洗滌:移去包被液,凹孔用洗滌緩沖液(含0.05%吐溫-20)洗3次,每次5分鐘。
 
3.每凹孔加入0.2 ml用稀釋緩沖液稀釋的含抗原的被檢標(biāo)本,37℃作用1~2小時(shí)。
 
4.洗滌:移去包被液,凹孔用洗滌緩沖液(含0.05%吐溫-20)洗3次,每次5分鐘。
 
5.加入0.2 ml用稀釋緩沖液稀釋的酶標(biāo)記特異性抗體溶液,37℃作用1~2小時(shí)或由預(yù)試實(shí)驗(yàn)確定作用時(shí)間。
 
6.洗滌:移去包被液,凹孔用洗滌緩沖液(含0.05%吐溫-20)洗3次,每次5分鐘。
 
7.加入0.2ml底物溶液于每個(gè)凹孔(OPD或OT),室溫作用30分鐘(另作一空白對(duì)照,0.4 ml底物加0.1 ml終止劑)。
 
8.加終止劑:每凹孔加2M H2SO4或2 M檸檬酸0.05 ml。
 
9.觀察記錄結(jié)果:目測(cè)或用酶標(biāo)比色計(jì)測(cè)定(OPD用492nm)OD值。

四、注意事項(xiàng)
1.可溶性抗原或抗體吸附于固相載體而成為不溶形式,這是進(jìn)行酶標(biāo)記測(cè)定的基本條件。許多物質(zhì)可作為固相載體,如纖維素、交聯(lián)右旋糖苷、聚丙烯、聚乙烯及聚氯乙烯等等。但在ELISA中
常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反應(yīng)板及塑料管。

2.包被所用的抗原必須是可溶性的,而且要求是優(yōu)質(zhì)和穩(wěn)定的制劑,純度和免疫原性要高。如果不純,由于抗原中所含雜質(zhì)就會(huì)競(jìng)爭(zhēng)固相載體上的有限位置,降低敏感性和特異性。此外還應(yīng)考慮到制備包被抗原不應(yīng)破壞其免疫學(xué)活性。


3.對(duì)某些抗原必須進(jìn)行提純,如病毒的組織培養(yǎng)和雞胚培養(yǎng)物以及病毒接種動(dòng)物的臟器等,它們當(dāng)中存在著許多非抗原的蛋白質(zhì),必須設(shè)法除去,常用梯度超速離心或親和層析法提純,不經(jīng)提純是不能使用的。

4.用適稀釋度抗原,包被固相載體不僅經(jīng)濟(jì),而且可以克服前帶現(xiàn)象??赏ㄟ^棋盤滴定法進(jìn)行測(cè)定,但用單項(xiàng)滴定法更為簡(jiǎn)便,其方法是將抗原進(jìn)行一系列稀釋包被微量反應(yīng)板,再用一定稀釋度的陽(yáng)性參考血清和陰性參考血清進(jìn)行孵育后洗滌,再加酶結(jié)合物進(jìn)行反應(yīng),經(jīng)孵育洗滌后,加底物溶液顯色,終止反應(yīng)后分別測(cè)定OD值,選擇OD值≥1.0的那個(gè)抗原稀釋度為適包被濃度。一般總是要選擇那個(gè)OD值稍大于1.0,而不選擇小于1.0的抗原濃度。陰性參考血清OD值要求<0.1-0.2。也就是要求陽(yáng)性參考血清和陰性參考血清的OD值有明顯差別。

 

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