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細(xì)胞裂怎么辦?

更新時(shí)間:2021-01-18   點(diǎn)擊次數(shù):1221次

     關(guān)于培養(yǎng)細(xì)胞樣品:

 
    1.融解ripa裂解液,混勻。取恰當(dāng)量的裂解液,在運(yùn)用前數(shù)分鐘內(nèi)參加pmsf,使pmsf的終濃度為1mm。
 
    2.關(guān)于貼壁細(xì)胞:去除培養(yǎng)液,用pbs、生理鹽水或無(wú)血清培養(yǎng)液洗一遍(假如血清中的蛋白沒(méi)有干擾,能夠不洗)。按照6孔板每孔參加150-250微升裂解液的份額參加裂解液。用槍吹打數(shù)下,使裂解液和細(xì)胞充沛接觸。一般裂解液接觸細(xì)胞1-2秒后,細(xì)胞就會(huì)被裂解。
 
    關(guān)于懸浮細(xì)胞:離心收集細(xì)胞,用手指把細(xì)胞用力彈散。按照6孔板每孔細(xì)胞參加150-250微升裂解液的份額參加裂解液。再用手指輕彈以充沛裂解細(xì)胞。充沛裂解后應(yīng)沒(méi)有明顯的細(xì)胞沉積。假如細(xì)胞量較多,必需分裝成50-100萬(wàn)細(xì)胞/管,然后再裂解。
 
    3.充沛裂解后,10000-14000g離心3-5分鐘,取上清,即可進(jìn)行后續(xù)的page、western和免疫沉積等操作。 
 
    裂解液用量說(shuō)明:一般6孔板每孔細(xì)胞參加150微升裂解液現(xiàn)已足夠,但假如細(xì)胞密度十分高能夠恰當(dāng)加大裂解液的用量到200微升或250微升。 
 
    關(guān)于安排樣品: 
 
    1.把安排剪切成細(xì)微的碎片。
 
    2.融解ripa裂解液,混勻。取恰當(dāng)量的裂解液,在運(yùn)用前數(shù)分鐘內(nèi)參加pmsf,使pmsf的終濃度為1mm。
 
    3.按照每20毫克安排參加150-250微升裂解液的份額參加裂解液。(假如裂解不充沛能夠恰當(dāng)增加更多的裂解液,假如需求高濃度的蛋白樣品,能夠恰當(dāng)減少裂解液的用量。)
 
    4.用玻璃勻漿器勻漿,直至充沛裂解。
 
    5.充沛裂解后,10000-14000g離心3-5分鐘,取上清,即可進(jìn)行后續(xù)的page、western和免疫沉積等操作。
 
    6.假如安排樣品本身十分細(xì)微,能夠恰當(dāng)剪切后直接參加裂解液裂解,通過(guò)激烈vortex使樣品裂解充沛。然后同樣離心取上清,用于后續(xù)試驗(yàn)。直接裂解的優(yōu)點(diǎn)是比較方便,不用運(yùn)用勻漿器,缺陷是不如運(yùn)用勻漿器那樣裂解得比較充沛。 
 
    注:ripa裂解液的裂解產(chǎn)品中經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)一小團(tuán)通明膠狀物,屬正?,F(xiàn)象。該通明膠狀物為含有基因組dna等的復(fù)合物。在不檢測(cè)和基因組dna結(jié)合特別緊密的蛋白的情況下,能夠直接離心取上清用于后續(xù)試驗(yàn);假如需求檢測(cè)和基因組結(jié)合特別緊密的蛋白,則能夠通過(guò)超聲處理打碎打散該通明膠狀物,隨后離心取上清用于后續(xù)試驗(yàn)。假如檢測(cè)一些常見(jiàn)的轉(zhuǎn)錄因子,例如nf-kappab、p53等時(shí),一般不用進(jìn)行超聲處理,就能夠檢測(cè)到這些轉(zhuǎn)錄因子。

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