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如何繪制出完美的標(biāo)準(zhǔn)曲線?

更新時間:2021-03-05   點(diǎn)擊次數(shù):2541次

       標(biāo)準(zhǔn)曲線法也稱為外標(biāo)法或直接比較法,是一種簡便、快速的定量方法,在ELISA實(shí)驗(yàn)中比較常用的一種分析方法。

 一、做標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品檢測時有幾個問題需要注意ELISA試劑盒

  1、樣品的濃度等指標(biāo)是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出來的,所以首先要把做標(biāo)準(zhǔn)曲線看作是比做正式實(shí)驗(yàn)還要重要的一件事,否則后面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果無從談起。
  2、設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品的標(biāo)準(zhǔn)濃度范圍要有一個比較大的跨度,并且要能涵蓋你所要檢測實(shí)驗(yàn)樣品的濃度,即樣品的濃度要在標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍之內(nèi),人ELISA試劑盒包括上限和下限。而對于呈S型的標(biāo)準(zhǔn)曲線,盡量要使實(shí)驗(yàn)樣品的濃度在中間坡度陡段,即曲線幾乎成直線的范圍內(nèi)。
  3、采用倍比稀釋法配制標(biāo)準(zhǔn)曲線中的標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度,這樣就能夠保證標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度不會出現(xiàn)較大的偏離。
  4、檢測標(biāo)準(zhǔn)樣品時,應(yīng)按濃度遞增順序進(jìn)行,以減少高濃度對低濃度的影響,提高準(zhǔn)確性。
  5、標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣品數(shù)一般為7個點(diǎn),但至少要保證有5個點(diǎn)。
  6、做出的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)因?qū)嶒?yàn)要求不同而有所變動,但一般來說,相關(guān)系數(shù)R至少要大于0.98,對于有些實(shí)驗(yàn),至少要0.99甚至是0.999.
  
二、選擇什么方程去擬合ELISA試劑盒
  在S曲線的低濃度部門可以用乘冪方程很好的擬合,中低濃度部門可以用直線方程,中間部門可用對數(shù)方程,而中后段可用四參數(shù)。免疫檢測時尺度點(diǎn)(可以是倍比稀釋的,也可以不是)濃度假如和相應(yīng)的吸光度(OD)值假如能夠呈現(xiàn)直線關(guān)系當(dāng)然是理想的了,這時可以通過EXELL等利便的獲得擬合曲線,進(jìn)而推算出樣品的濃度值。
  關(guān)于尺度曲線的擬合方式,直線、二次曲線、三次曲線、指數(shù)、對數(shù)等雖都可用于ELISA及其它生物學(xué)反應(yīng)中的曲線擬合,但都只合用于曲線的一部門,有的合用于前半段,有的合用于后半段,有的合用于中間一段,而Logistic曲線則對曲線的全部都有較好的合用性。在一個長的區(qū)間內(nèi),Logistic應(yīng)該都能擬合得較為理想。假如用來定量,S形曲線的中間段(較陡處)是比較好的,而兩真?zhèn)€平坦部門計(jì)算誤差會大,有時甚至?xí)艽?。用于免疫檢測的所謂“尺度曲線”實(shí)在稱為擬合曲線比較合適。目前上流行的免疫檢測擬合方式是“四參數(shù)邏輯擬合”,用這種擬合方式往往能夠比較準(zhǔn)確的反映濃度和吸光度的曲線關(guān)系,從而進(jìn)一步比較準(zhǔn)確的獲得樣品中待測物質(zhì)的濃度值。但我們做免疫檢測很少有時候能夠有這么理想的情況,標(biāo)品濃度和相應(yīng)OD值往往是"ELISA試劑盒S"型的曲線關(guān)系,這時就不能用直線擬合的方式了,而對擬合方法進(jìn)行選擇就是必要的了。樞紐在于你的尺度曲線做到了S形的哪一部門,你想檢測的樣品濃度在曲線的哪一部門。人ELISA試劑盒當(dāng)然,假如用于定量,仍是在中間一段較好。但建模型是一回事,而用它來定量是另一回事。這些方法固然沒有一種方法可以通用,但也都可以用。但并不是說它就是萬能的。事實(shí)上不僅是ELISA試劑盒,其它良多生物學(xué)反應(yīng)都是S形曲線,也都可以用Logistic曲線擬合。
 
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