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ELISA技術(shù)綜述(一)

更新時間:2023-05-08   點擊次數(shù):721次


ELISA原理

 

ELISA利用抗原抗體之間專一性結(jié)合之特性,對標本進行檢測;由于結(jié)合與固體承載物(一般為塑膠孔盤)上之抗原或抗體仍可具有免疫活性,因此設計 其結(jié)合 機制後,配合酵素顯色反應,即可顯示特定抗原或抗體是否存在,并可利用顯色之深淺進行定量分析。根據(jù)待測樣品與結(jié)合機制的不同,ELISA可設計出各種不 同類型的檢測方式,主要以"三明治法"(sandwich)、"間接法"(indirect)、以及"競爭法"(Competitive)三種為主,以下 為各種方法之介紹。

 

ELISA分類

 

ELISA的雙抗夾心法原理;

 

ELISA的雙抗夾心法,又稱"三明治法"

 

三明治法常用于檢測大分子抗原,一般之操作步驟為:

 

將具有專一性之抗體固著(coating)于塑料孔盤上,完成後洗去多馀抗體;

加入待測標本,標本中若含有待測之抗原,則其會與塑料孔盤上的抗體進行專一性結(jié)合;

洗去多馀待測標本,加入標記有酵素之二次抗體,與抗原結(jié)合;

洗去多馀未結(jié)合的二次抗體,加入酵素受體使呈色,以肉眼或儀器讀取顯色結(jié)果。

 

三明治法分別以兩種抗體對標本中的抗原進行兩次專一性辨認,因此專一性相當高,但此待測抗原必須是多價抗原,如此才可獲得兩種以上的專一性抗體,以分別進行夾心;而且此法需要足夠的表位空間以進行抗原抗體的夾心,所以并不適用于半抗原或小分子抗原等分子量較小之標的。

 

ELISA雙抗夾心法的衍生方法如ABC法:ELISA的生物素 -親和素系統(tǒng),該產(chǎn)品系列是檢測方法上的重要革命。生物素/親和素系統(tǒng)用于ELISA一般有三種形式,即橋聯(lián)法(BAB)、標記法 (BA)和ABC法,不少學者用之檢測了不同的抗原—抗體系統(tǒng)均取得了較好的結(jié)果,其中以BA法和ABC法應用較多,敏感性一般比常規(guī)ELISA法高 480倍。

 

LISA的間接法:

 

間接法常用于檢測抗體,一般之操作步驟為:

將已知之抗原固著于塑膠孔盤上,完成後洗去多馀之抗原;

加入待測標本,標本中若含有待測之一次抗體,則其會與塑膠孔盤上的抗原進行專一性結(jié)合;

洗去多馀待測標本,加入帶有酵素之二次抗體,與待測之一次抗體結(jié)合;

洗去多馀未結(jié)合的二次抗體,加入酵素受體使酵素顯色,以肉眼或儀器讀取顯色結(jié)果。

 

ELISA的競爭法原理;

 

競爭法是一種較少用到的ELISA檢測機制,一般用于檢測小分子抗原,其操作步驟為:

將具有專一性之抗體固著于塑膠孔盤上,完成後洗去多馀抗體;

加入待測標本,使標本中的待測抗原與塑膠孔盤上的抗體進行專一性結(jié)合;

加入帶有酵素之抗原,此抗原也可與塑膠孔盤上的抗體進行專一性結(jié)合,由于塑膠孔盤上固著的抗體數(shù)量有限,因此當標本中抗原的量越多,則帶有酵素之抗原可結(jié)合的固著抗體就越少,亦即,兩種抗原皆競相與塑膠孔盤上抗體結(jié)合,即所謂競爭法之由來。

洗去標本與帶有酵素之抗原,加入酵素受體使酵素顯色,當標本中抗原量越多,代表塑膠孔盤內(nèi)留下的帶有酵素的抗原越少,顏色也就越淺。

當需要檢測無法獲得兩種以上單一性抗體的抗原,或是不易得到足夠的純化抗體以固著在塑膠孔盤上時,一般會考慮使用競爭法ELISA


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