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ELISA技術(shù)綜述(四)

更新時(shí)間:2023-05-29   點(diǎn)擊次數(shù):723次

2.4  結(jié)合物的保存

酶標(biāo)抗體中的酶和抗體均為生物活性物質(zhì),保存不當(dāng),極易失活。高濃度的結(jié)合物較為穩(wěn) 定,冰凍干燥后可在普通冰箱中保存一年左右,但凍干過程中引起活力的減低,而且使用時(shí)需經(jīng)復(fù)溶,頗為不便。結(jié)合物溶液中加入等體積的甘油可在低溫冰箱或普 通冰箱的冰格中較長時(shí)間保存。早期的ELISA試劑盒中的結(jié)合物一般均按以上兩種形式供應(yīng),配以稀釋液(見3.2.5)臨用時(shí)按標(biāo)明的稀釋度稀釋成工作 液?,F(xiàn)在較先進(jìn)的ELISA試劑盒均已用合適的緩沖液配成工作液,使用時(shí)不需再行稀釋,在4-8℃保存期可達(dá)6個(gè)月。由于蛋白質(zhì)濃度較低,結(jié)合物易失活, 需加入蛋白保護(hù)劑。另外再加入抗生素(例如慶大霉素)和防腐劑(HRP結(jié)合物加硫柳泵,AP結(jié)合物可加疊氮鈉),以防止細(xì)菌生長。

 

2.5 結(jié)合物的稀釋液

用于稀釋高濃度的結(jié)合物以配成工作液。為避免結(jié)合物在反應(yīng)中直接吸附在固相載體上,在稀釋緩沖液中常加入高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)(例如1%牛血清白蛋白), 通過競爭以抑制結(jié)合物的吸附。一般還加入具有抑制蛋白質(zhì)吸附于塑料表面的非離子型表面活性劑,如吐溫20,0.05%的濃度較為適宜。在間接測定抗體時(shí), 血清標(biāo)本需稀釋后進(jìn)行測定,也可應(yīng)用這種稀釋液。

 

3. 酶的底物

 

3.1HRP的底物

HRP催化過氧化物的氧化反應(yīng),具代表性的過氧化物為H2O2,其反應(yīng)式如下:

DH2+ H2O2 D+ H2O

上式中,DH2為供氧體,H2O2為受氫體。在ELISA中,DH2一般為無色化合物,經(jīng)酶作用后成為有色的產(chǎn)物,以便作比色測定。常用的供氫體有鄰苯 二胺(O-phenylenediamine,OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine,TMB)ABTS[2,2'-azino-di-(3-ethylbenziazobine sulfonate-6)]。

OPD氧化后的產(chǎn)物呈橙紅 色,用酸終止酶反應(yīng)后,在492nm處有最高吸收峰,靈敏度高,比色方便,是HRP結(jié)合物常用的底物。OPD本身難溶于水,OPD·2HCL為水溶性。 曾有報(bào)道OPD有致異變性,操作時(shí)應(yīng)予注意。OPD見光易變質(zhì),與過氧化氫混合成底物應(yīng)用液后更不穩(wěn)定,須現(xiàn)配置現(xiàn)用。在試劑盒中,OPDH2O2一般 分成二組分,OPD可制成一定量的粉劑或片劑形式,片劑中含有發(fā)泡助溶劑,使用更為方便。過氧化氫則配入底物緩沖液中,有制成易保存的濃縮液,使用時(shí)用蒸 餾水稀釋。先進(jìn)的ELISA試劑盒中則直接配成含保護(hù)劑的工作濃度為0.02% H2O2的應(yīng)用液,只需加入OPD后即可作為底物應(yīng)用液。

 

 

TMB經(jīng)HRP作用后共產(chǎn)物顯藍(lán)色,目視對比鮮明。TMB性質(zhì)較穩(wěn)定,可配成溶液試劑,只需與H2O2溶液混和即成應(yīng)用液,可直接作底物使用。另 外,TMB又有無致癌性等優(yōu)點(diǎn),因此在ELISA中應(yīng)用日趨廣泛。酶反應(yīng)用HCLH2SO4終止后,TMB產(chǎn)物由藍(lán)色呈黃色,可在比色計(jì)中定量,最適吸 收波長為405nm。

ABTS雖不如OPDTMB敏感,但空白值極低,也為一些試劑盒所采用。

 

 

另一種HRP的底物為3-(4-羥基)苯丙酸[3-(4-hydroxy)phenly propionic acid,HPPA],經(jīng)HRP作用后,產(chǎn)物顯熒光,可用熒光光度計(jì)測量。用于ELISA的優(yōu)點(diǎn)為可加寬定量測定的線性范圍。

 

 

HRP對氫受體的專一性很高,僅作用于H2O2、小分醇的過氧化物和尿素過氧化物(urea peroxide)H2O2應(yīng)用最多,但尿素過氧化物為 固體,作為試劑較H2O2方便、穩(wěn)定。試劑盒供應(yīng)尿素過氧化物片劑,用蒸餾水溶解后,在底物緩沖液中密閉、低溫(28℃)可穩(wěn)定1年。

 

3.2 AP的底物

AP為磷酸酯酶,一般采用對硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate,p-NPP)作為底物,可制成片劑,使用方便。產(chǎn)物為黃色 的對硝基酚,在405nm波長處有吸收峰。用NaOH終止酶反應(yīng)后,黃色可穩(wěn)定一時(shí)間。AP也有發(fā)熒光底物(磷酸4-甲基傘酮),可用于ELISA作熒光 測定,敏感度較高于用顯色底物的比色法。

 

4.  洗滌液

在板式ELISA中,常用的稀釋液為含0.05%吐溫20磷酸緩沖鹽水。

 

 

5. 酶反應(yīng)終止液

常用的HRP反應(yīng)終止液為硫酸,其濃度按加量及比色液的最終體積而異,在板式ELISA中一般采用2mol/L。

 

6. 陽性對照品和陰性對照品

陽性對照品(positive control)和陰性對照品(negative control)是檢驗(yàn)試驗(yàn)有效性的控制品,同時(shí)也作為判斷結(jié)果的對 照,因此對照品,特別是陽性對照品的基本組成應(yīng)盡量與檢測標(biāo)本的組成相一致。以人血清為標(biāo)本的測定,對照品最好也為人血清,因?yàn)檎H搜逶诟鞣N ELISA模式中可產(chǎn)生不同程度的本底。由于大量正常人血甭較難得到,國外試劑盒中的對照品多以復(fù)鈣人血漿 (recalcified human plasma)為原料,即在血漿中加入鈣離子,使其中的纖維蛋白質(zhì)凝固,除去凝塊后所得的液體,其組成與血清相 似。陰性對照品須先行檢測,確定其中不含待測物質(zhì)。例如HBsAg檢測的陰性對照品中不可含HBsAg,最好抗HBs也是陰性。陽性對照品多以含蛋白保護(hù)劑的緩沖液為基質(zhì),其中加入一定量的待檢物質(zhì),此量最好在試劑說明書中標(biāo)明。加入的量應(yīng)與試劑的敏感度相稱,在測定中得到的吸光值與受檢標(biāo)本吸光值比較, 可對標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量有一個(gè)粗略的估計(jì)。國外檢測HBsAgELISA試劑盒檢測敏感度約為0.5ng/ml,陽性對照品中含量約為10ng/ml。 在對照品中一般加入抗生素和防腐劑,以利保存。

 

 

7. 參考標(biāo)準(zhǔn)品

 

定量測定的ELISA試劑盒(例如甲胎蛋白質(zhì)癌胚抗原測定等)應(yīng)含有制作標(biāo)準(zhǔn)曲線用的參考標(biāo)準(zhǔn)品,應(yīng)包括覆蓋可檢測范圍的4-5個(gè)濃度,一般均配入含蛋白保護(hù)劑及防腐劑的緩沖液中。


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