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ELISA技術(shù)操作要點

更新時間:2011-10-14   點擊次數(shù):1964次

ELISA技術(shù)操作要點,酶和底物

ELISA中所用的酶要求純度高、催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高、專一性強(qiáng)、性質(zhì)穩(wěn)定、來源豐富、價格不貴、制備成的酶標(biāo)抗體或抗原性質(zhì)穩(wěn)定,繼續(xù)保留著它的活性部分和催化能力。在受檢標(biāo)本中不存在與標(biāo)記酶相同的酶。另外它的相應(yīng)底物應(yīng)易于制備和保存,價格低廉,有色產(chǎn)物易于測定,光吸收高。ELISA中zui常用的酶為辣根過氧化酶(HRP)和從牛腸粘膜或大腸桿菌提取的堿性磷酸酶(AP)。

HRP在蔬菜作物辣根中含量很高,純化方法也不復(fù)雜。它是一種糖蛋白,含糖量約18%;分子量為44kD;是一種復(fù)合酶,由主酶(酶蛋白)和輔基(亞鐵血紅素)結(jié)合而成的一種卟啉蛋白質(zhì)。主酶為無色糖蛋白,在275nm波長處有zui高吸收峰;輔基是深棕色的含鐵卟啉環(huán),在403nm波長處有zui高吸收峰。

ELISA技術(shù)操作要點,結(jié)合物

酶標(biāo)記的抗原或抗體稱為結(jié)合物(conjugate)??乖捎诨瘜W(xué)結(jié)構(gòu)不同,可用不同的方法與酶結(jié)合。如為蛋白質(zhì)抗原,基本上可參考抗體酶標(biāo)記的方法。制備抗體酶結(jié)合物的方法通常有以下幾種。

1.戊二醛交聯(lián)法戊二醛是一種雙功能團(tuán)試劑,可以使酶與蛋白質(zhì)或其他抗原的氨基通過它而偶聯(lián)。戊二醛交聯(lián)可用一步法(如連接AP),也可用二步法(如連接HRP)。舉例如下:

2~5mg純抗體與5mgAP混合于0.1mol/LpH6.8的磷酸緩沖液1ml中,4℃下對同上緩沖液透析平衡。磁力攪拌下,緩慢加入1%戊二醛0.05ml,在室溫下放置2小時。在4℃下對0.05mol/LpH8.0Tris緩沖液透析平衡,即得酶標(biāo)抗體。

辣根過氧化物酶可溶解于50%飽和度硫酸銨中。用上法交聯(lián)后可用50%飽和度硫酸銨沉淀酶標(biāo)抗體,棄去上清中游離酶。

戊二醛一步法操作簡便、有效,而且重復(fù)性好。缺點是交聯(lián)時分子間的比例不嚴(yán)格,大小也不一,影響效果。

制備HRP抗體結(jié)合物也可用二步法,即先將HRP與戊二醛作用,透析除去戊二醛,在pH9.5緩沖液中再與抗體作用而形成酶標(biāo)抗體。此法的效率可高于一步法10倍左右。

2.過碘酸鹽氧化法本法只用于HRP的交聯(lián)。該酶含18%碳水化合物,過碘酸鹽將其分子表面的多糖氧化為醛基。用硼氫化鈉(NaBH4)中和多余的過碘酸。酶上的醛根很活潑,可與蛋白質(zhì)結(jié)合,形成按摩爾比例結(jié)合的酶標(biāo)結(jié)合物。有人認(rèn)為此法為辣根過氧化物酶交聯(lián)zui有效的方法。但也有只認(rèn)為由于所用試劑較為劇烈,各批實驗結(jié)果不易重復(fù)。

聯(lián)


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