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酶法提取膠原蛋白的方法介紹

更新時(shí)間:2023-08-08   點(diǎn)擊次數(shù):541次

酶法提取是指可溶性膠原和酸溶性膠原被提取后,需用一些蛋白酶,如膠原酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰凝乳蛋白酶等水解,得到不同的酶促溶性膠原蛋白。所使用的蛋白酶主要分3種:動(dòng)物蛋白酶(如胰蛋白酶,胃蛋白酶),植物蛋白酶(如木瓜蛋白酶,菠蘿蛋白酶),微生物蛋白酶(如堿性蛋白酶,中性蛋白酶)。在對(duì)酶法水解膠原蛋白的研究中,以堿性蛋白酶應(yīng)用zui多。

 

將膠原進(jìn)行限制性降解,即將末端肽切割下來,由于膠原肽鏈間的共價(jià)鍵都是通過分子末端肽里的賴氨酸或羥賴氨酸的相互作用形成的,末端肽被切下后,含三螺旋結(jié)構(gòu)的主體部分可溶于稀有機(jī)酸而被提取出來。用酶處理,可以水解掉膠原纖維蛋白的末端肽,提高膠原蛋白的產(chǎn)率;而且還不會(huì)破壞膠原蛋白的三股螺旋結(jié)構(gòu),保持其特性。影響酶提取的因素有很多,如酶濃度、酶與底物的比例、酶解時(shí)間、酶解溫度、pH值以及料液比等。在實(shí)際操作中,大多數(shù)采用酶復(fù)合法提取膠原蛋白,較多的是使用胃蛋白酶提取,有機(jī)酸多為乙酸。

 

酶解膠原蛋白的工藝主要分為單酶水解法和多酶水解法。多酶水解法又分為混合酶水解法(比如牛胰蛋白酶,鏈霉菌蛋白酶,芽孢桿菌蛋白酶混合)和分步酶水解法,酶法提取皮膠原具體實(shí)驗(yàn)工藝及條件的選取通常應(yīng)考慮要開發(fā)的產(chǎn)品對(duì)分子量的要求,要得到分子量較小的膠原多肽一般采用多酶水解法。影響酶解效果的因素主要有:酶的種類、加酶量、酶解溫度、酶解時(shí)間、pH值及料水比。采用酶法提取骨料中的膠原蛋白,既能有效縮短提取時(shí)間,又能獲得具有良好生物活性的膠原蛋白,而且對(duì)環(huán)境的污染也較小。膠原蛋白不易被普通蛋白酶水解,但能被動(dòng)物膠原酶斷裂,斷裂的碎片自動(dòng)變性后可被普通蛋白酶水解。胃蛋白酶水解膠原蛋白的適宜條件為pH 1.651.70、溫度37℃。

 

有人以豬骨為原料,用蛋白酶的酶解反應(yīng)代替?zhèn)鹘y(tǒng)制膠工藝,對(duì)骨膠原的酶解反應(yīng)與酶法制膠工藝進(jìn)行了試驗(yàn)研究。結(jié)果表明:以胃蛋白酶對(duì)骨膠原的提取率zui高(46.14%),其次是胰蛋白酶(43.42%),接下來是中性蛋白酶(30.14%),zui后是堿性蛋白酶(21.15%)。并且通過單因素和正交試驗(yàn)對(duì)胃蛋白酶酶解反應(yīng)中各主要影響因素進(jìn)行了優(yōu)化。試驗(yàn)結(jié)果表明,胃蛋白酶提取的zui you條件是,胃蛋白酶的濃度是1%,在pH2.0的條件下酶解48h,然后在濃度為10%w/v)的NaCL溶液中鹽析24h,zui后骨膠原的回收率為64.77%,骨膠原的提取率為49.75%。還有人用胃蛋白酶提取豬皮膠原蛋白,分別在水解0、2、610、1418、22、26h時(shí)對(duì)四種不同胃蛋白酶用量(分別為1%2%、2.5%3%)的試樣取樣檢測,采用一階HILL方程模擬胃蛋白酶提取豬皮膠原蛋白的進(jìn)程以及胃蛋白酶水解速率的衰減過程,zui后得出2%的胃蛋白酶用量和6-7h的水解時(shí)間提取率zui大。還有人用以新鮮豬皮為原料,在50-52℃的條件下用胰酶進(jìn)行水解,在酶用量為 50001100001,pH值為9,反應(yīng)23h,原料:水為12的條件下酶解。結(jié)果表明:總蛋白質(zhì)的提取率≥80%。

 

采用酶法提取膠原蛋白時(shí),必須嚴(yán)格控制提取條件:

 

首先,酶作用時(shí)間必須適當(dāng)。如果時(shí)間過短,膠原蛋白就不能充分釋放到提取液中,影響提取率;如果酶作用時(shí)間過長,膠原蛋白會(huì)水解過度,產(chǎn)生過多的苦味小分子低聚肽,不僅會(huì)增加分離純化的難度,也會(huì)影響膠原蛋白的功能特性和生物活性。

 

其次,酶解溫度要適宜。溫度過低,酶的作用效果不明顯;溫度過高會(huì)引起酶的失活和膠原蛋白的變性。據(jù)報(bào)道,當(dāng)介質(zhì)pH略低于中性時(shí),膠原蛋白的變性溫度為4041℃,當(dāng)介質(zhì)pH為酸性時(shí),膠原蛋白的變性溫度為3839℃,而且魚皮膠原蛋白的變性溫度要比豬皮膠原蛋白的變性溫度低712℃。所以,如果要使提取的膠原蛋白具有良好的生物活性,在提取過程中應(yīng)使提取溫度低于變性溫度。

 

第三,需選用適當(dāng)?shù)拿?。一般從陸生哺乳?dòng)物組織中提取膠原蛋白時(shí),采用胃蛋白酶在其zui適作用溫度下進(jìn)行提取是合理的,但對(duì)于魚類等水生動(dòng)物,由于其膠原蛋白的變性溫度比陸生哺乳動(dòng)物低,因此許多蛋白酶便不適用,如果在這些酶的zui適作用溫度下提取可能會(huì)破壞膠原蛋白的某些功能特性和生物活性。采用酶法提取膠原蛋白及其多肽的研究主要是從動(dòng)物皮及其加工副產(chǎn)物中,應(yīng)用酶法從動(dòng)物骨中提取膠原蛋白及其多肽報(bào)道較少。


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