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諾如病毒ELISA檢測方法步驟

更新時間:2011-11-08   點擊次數(shù):3460次

諾如病毒ELISA檢測方法步驟

一、標本的采集和儲存

出現(xiàn)癥狀后72小時內(nèi)采樣。
糞便量盡量不少于5ml。
貯存于2~8℃,但zui多不能超過3天;長期貯存應在-20℃或-70℃。
成形便和肛拭子診斷意義較小。

二、所需材料

 IDEIA™ norovirus試劑盒(DakoCytomation公司)
     1000µl和200µl微量加樣槍及相應不帶濾芯的槍頭
     酶標儀
     洗板機
     吸水性能好的衛(wèi)生紙
     去離子水(無須高壓)或蒸餾水
     渦漩震蕩器
     離心機
     50ml管、1.5ml EP管及相應的架子

三、檢測前準備

將試劑和待檢測標本置于室溫(15~30℃)30min。
     陰性對照:將1ml樣品稀釋液(sample diluent)加至標記好的小瓶中作為陰性對照。
     陽性對照:1ml陽性對照液(positive control)溶解一瓶陽性對照, 顛倒混勻。未用完的陽性對照可在2~8℃貯存1個月,長期貯存應分裝存于-20℃。
     每次檢測均至少一個陽性對照和一個陰性對照。
     空白對照:空氣
     洗液的配制:1倍體積的洗液濃縮液(WASH BUFFER×25)加24倍體積的去離子水,當天用當天配。

四、標本準備

加入1ml樣品稀釋液至1.5ml 小離心管中,然后,加入0.1g固體糞便標本或0.1ml液體糞便標本,置于漩渦震蕩器充分混勻,室溫靜置10min,室溫下≥5000rpm離心5min,取上清進行檢測或置-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

五、檢測步驟

1、將需要數(shù)量的微孔板置于微孔板架上。

2、每孔加入100µl 10%便懸液以及陰性對照,陽性對照。

3、每孔加入2滴(或100µl)酶結合物(conjugate),用槍頭輕柔混勻(上下5次左右),20~30℃靜置60±5min。

4、每孔加入350µl洗液(用手輕微搖動1 min左右),棄去洗液,在衛(wèi)生紙上拍干,共洗5次。

5、每孔加入2滴(或100µl)底物液(Substrate),20~30℃靜置30min。待藍色顯現(xiàn)后迅速觀察顏色。

6、每孔加入2滴(或100µl)終止液(Stop solution),充分混勻。

7、讀取OD450值,打印輸出或記錄值。結果必須在加入終止液后30min內(nèi)讀取。

六、結果判定

陰性對照:肉眼觀察無色或OD450值<0.15。

陽性對照:肉眼觀察呈現(xiàn)*的藍色或OD450值>0.50。

臨界值(cut-off value):OD450值=陰性對照OD450值+0.10。

標本:

a)肉眼觀察藍色比陰性對照顏色深判定為陽性,肉眼觀察無色判定為陰性。

b)OD450值大于臨界值判定為陽性,小于臨界值判定為陰性,OD450值在臨界值±0.01

范圍內(nèi)判定為可疑,應重復檢測或重新取樣。判斷陰陽結果按上述方法進行。若OD450值在臨界值仍在±0.01范圍內(nèi),仍判定為可疑,對于可疑樣品應用PCR方法來判定zui終結果。

七、注意事項

1、便標本處理時震蕩時應充分震蕩,特別是成形便或稀便,以便于病毒從標本中釋放出來。

2、加酶結合物(conjugate)后應用槍頭輕柔混勻(上下5次左右),以便于抗原抗體充分結合。

3、讀取吸光度應在加完終止液之后30min內(nèi)完成。

4、所有標本和陽性對照必須被當作具有潛在感染性的物質進行處理。

5、打開后的96微孔板應置于可封口的有干燥劑的口袋中貯存于2~8℃,打開后6周內(nèi)用完。

6、終止液中含0.46mol/L硫酸,避免接觸到皮膚和眼睛。如果終止液接觸到這些部位立即用水沖洗。

7、底物液避光保存,不使用已經(jīng)變藍的底物液。

8、避免試劑、金屬離子、氧化性物質及微生物污染。

9、因標本中可能存在某些腺病毒,該病毒具有與眼結膜結合的能力,在檢測過程中應避免手與眼的接觸。

10、ELISA板微孔不能反復使用。

本公司專業(yè)提供原裝RD試劑盒,RB試劑盒,IBL試劑盒,提供免費待測服務!

 檢測標本:血清或血漿/本產(chǎn)品僅供科研使用

供應商:上海恒遠生物科技有限公司(國內(nèi)供應商)

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產(chǎn)品目錄參見:http://xmhfl.com。
 

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