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探討兩種方法檢測HBsAg假陽性和假陰性的影響因素

更新時間:2023-12-26   點擊次數(shù):618次

     為了減少HBsAg檢測出現(xiàn)假陽性和假陰性,我們有必要對這種現(xiàn)象的原因進行分析,在實際的檢測工作中,造成HBsAg檢測出現(xiàn)假陽性和假陰性主要受以下因素影響,分述如下:

1、ELISA法假陰性原因

1.1 標本用肝素或EDTA等抗凝處理易造成HBsAg檢測結(jié)果假陰性,肝素抗凝血漿會增加OD,可能與高濃度肝素具有強大的負電荷,能吸附酶標記物不易洗脫有關(guān);EDTA、酶抑制劑(如NaN3)可抑制ELISA系統(tǒng)中的辣根過氧化物酶活性,造成假陰性。

 

1.2 標本保存不當,在冰箱內(nèi)保存過久的標本,血清中IgG可聚合成多聚體、AFP可形成二聚體。標本放置時間延長(如一天以上),有時抗原或抗體免疫活性減弱,便出現(xiàn)假陰性。因此若采血后不能及時檢測,5天內(nèi)檢測標本分離血清置于4。C冰箱內(nèi);超過5天不能檢測的,應放在-20。C低溫冰箱中。

 

1.3 低濃度HBsAg標本(弱陽性HBsAg)易受加樣時間(特別是大批量標本)、試劑平衡時間、溶血程度的影響,出現(xiàn)假陰性。如加樣時間在30分鐘內(nèi)的差異是zui大的。

 

1.4 高濃度HBsAgELISA一步法檢測中易出現(xiàn)假陰性,即HBsAg的鉤狀效應。從原理來講,一步法中HBsAg與包被板上的HBsAb及酶結(jié)合的HBsAb結(jié)合是雙向的,當HBsAg濃度過高時,HBsAg與包被板上的抗體及酶結(jié)合物中的抗體均是單向結(jié)合,不能形成抗體-抗原-抗體酶復合物,使酶標記抗體在隨后的洗板中洗掉,從而顯出陰性結(jié)果。但是在ELISA兩步法中,高濃度的HBsAg只能與包被的HBsAb“飽和"地結(jié)合,多余部分被洗掉,隨后加入的酶結(jié)合的HBsAb正好通過HBsAg的“橋梁"作用而結(jié)合在酶標板上,顯示陽性結(jié)果。因此當HBsAg強濃度時用ELISA一步法檢測存在假陰性現(xiàn)象。解決此問題的zui hao辦法有:對標本進行稀釋;不單檢測HBsAg;采用ELISA兩步法檢測可消除漏檢現(xiàn)象。

 

1.5 由于慢性病毒攜帶者(低水平HBsAg攜帶者)HBV感染的潛伏期,HBsAg濃度低于檢測水平的下限,由此造成假陰性。

 

1.6 S基因突變導致HBsAg的氨基酸結(jié)構(gòu)改變,由于多數(shù)商用試劑盒檢測系統(tǒng)采用的為多克隆抗體檢測HBsAga決定簇,這一區(qū)域的點突變即可導致臨界觀測值或陰性結(jié)果,造成假陰性。

 

2ELISA法假陽性原因

2.1溶血或紅細胞:有國內(nèi)報道酶免HBsAg試劑檢測溶血標本時可造成假陽性,因紅細胞破壞溶解時釋放出大量血紅蛋白,血紅蛋白的亞鐵血紅素具有弱過氧化物酶活性,其作用效應與辣根過氧化物酶(HRP)類似,能與預包被抗體(Ab)結(jié)合,一步法洗脫步驟往往難以wan全洗脫,殘留的過氧化物酶催化底物四甲基聯(lián)苯胺(TMB)產(chǎn)生假陽性。因此在采集血標本時,量不能太少,操作過程中如果血清混濁,一定要離心后再吸樣,避免紅細胞加入造成假陽性。對于溶血的標本zui重新采集血液,進行重新檢測。

 

2.2 標本凝集不全或標本離心處理時采用不同的離心轉(zhuǎn)速和離心時間,也可造成假陽性結(jié)果。若在血液還未開始凝固時即強行分離血清,此時的血清中仍殘留部分纖維蛋白原,在ELISA測定過程中可以形成肉眼可見的纖維蛋白塊,易造成假陽性結(jié)果;離心轉(zhuǎn)速過低或離心時間過短,由于血液離心不充分均可導致假陽性。解決的辦法zui是血液標本采集后放水浴箱,使其充分凝固再用3000rpm,離心15分鐘再分離血清。

 

2.3 干擾物質(zhì)的影響:如類風濕因子(RF)、補體、AFP等可以造成HBsAg檢測結(jié)果假陽性。RF因子可與標記二抗的Fc段結(jié)合造成假陽性;補體從C1q活化,使一抗和酶標二抗的抗體分子發(fā)生變構(gòu),FcC1q分子結(jié)合點暴露出來,則補體C1q可將二者連接起來造成假陽性,采用56。C30分鐘滅活補體可降低假陽性率;高濃度的AFP(如孕婦),在儲存過程中可能形成二聚體會導致本底過深造成假陽性結(jié)果。

 

2.4 某些細菌污染標本(如表皮球菌等),菌體中可能含有內(nèi)源性HRP,造成檢測結(jié)果假陽性。        

        


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