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免疫熒光標(biāo)記樣品

更新時間:2012-02-21   點(diǎn)擊次數(shù):2073次

用于流式細(xì)胞 儀檢測的常用熒光素有FITC、TRITC、Cy3、Cy5,PE和PI,在以上各種熒光染料中,PE熒光zui強(qiáng),適用于弱表達(dá)抗原;FITC*,適用于強(qiáng)表達(dá)抗原,適用范圍廣。

1.直接免疫熒光標(biāo)記法

取一定量的細(xì)胞懸液(濃度約1×106 個/ml),直接加入熒光素標(biāo)記抗體進(jìn)行免疫反應(yīng)(如做雙重標(biāo)記或多重標(biāo)記染色,可把幾種標(biāo)記有不同熒光素的抗體同時加入)。4℃孵育15~30分鐘后,用1/15mol/LPBS(pH 7.2~7.4)洗1~2次,加入緩沖液重懸,上機(jī)檢測。

本方法操作簡便,結(jié)果準(zhǔn)確,易于分析,適用于同一細(xì)胞群多參數(shù)同時測定。雖然直接熒光抗體標(biāo)記試劑成本較高。但減少了間接標(biāo)記法中較強(qiáng)的非特異熒光干擾,因此更適用于臨床標(biāo)本的檢測。

2.間接免疫熒光標(biāo)記法

取一定量的細(xì)胞懸液(濃度約5×106 個/ml),加入特異性*抗體,4℃孵育15~30分鐘,待反應(yīng)*后用磷酸緩沖液洗去未結(jié)合抗體,吸盡殘留液體,再加入熒光標(biāo)記第二抗體,4~C孵育30分鐘,抗原―抗體―抗抗體復(fù)合物,洗滌后即可上機(jī)檢測。注意:在整個熒光標(biāo)記過程中均需參考免疫熒光細(xì)胞化學(xué)間接法染色程序,尤其是加入一抗前需使用正常非免疫血清封閉,以減少非特異性反應(yīng)。如果對于未經(jīng)固定的細(xì)胞需使用0.3%TritonX-100為細(xì)胞膜打孔,以保證抗體能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。

此法費(fèi)用較低,二抗應(yīng)用廣泛,多用于科研樣品檢測。但是,由于非特異性熒光背景較強(qiáng),

影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果,在樣品制備時應(yīng)加人陰性或陽性對照。另外,由于間接法步驟較多,尤其是經(jīng)過多次洗滌,均可使細(xì)胞數(shù)量驟減,因此,在加入*抗體前細(xì)胞懸液的細(xì)胞濃度約5×106個/ml,上機(jī)檢測前不少于1×106 個/ml即可,此法不適用測定細(xì)胞數(shù)較少的樣品。

3.熒光標(biāo)記中的注意事項(xiàng)

① 為減少非特異性干擾,熒光標(biāo)記物用前應(yīng)用0.22um濾膜過濾或高速離心5分鐘,以除去顆粒或沉渣。

② 細(xì)胞樣品的制備、染色及保存均應(yīng)該盡量保持新鮮,防止分解代謝引起的表面抗原消失及細(xì)胞死亡,可以通過加入營養(yǎng)培養(yǎng)基或低濃度血清以及4~0或冰浴中操作來解決。

③ 細(xì)胞或低比例細(xì)胞亞群分析時,為保證準(zhǔn)確,應(yīng)排除死細(xì)胞。

④ 熒光標(biāo)記抗體濃度應(yīng)該合適,如果濃度過高,會使非特異性結(jié)合增加。在使用一抗之前,將樣品與過量的牛血清白蛋白(BSA)或來源于同一種屬的正常血清一起孵育,以阻斷一抗和細(xì)胞表面或胞內(nèi)結(jié)構(gòu)非特異性作用。在使用一抗之后,將樣品、與二抗相同種屬的5%~10%正常血清和二抗一起孵育,以減少二抗與一抗、細(xì)胞表面或胞內(nèi)結(jié)構(gòu)之間的非特異相互作用。如果使用含有與一抗或二抗種屬相同的血清液體稀釋抗體,便可以省略此步驟。

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