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禽流感病毒RNA提取方法

更新時間:2012-12-10   點擊次數:1972次

Trizol法提禽流感病毒protocol
Trizol法適用于人類、動物、植物、微生物的組織或培養(yǎng)細菌,樣品量從幾十毫克至幾克。
1、 取雞胚尿囊液,加入5-10倍體積 Trizol液,混勻;
2、 室溫放置5分鐘,然后以每1ml Trizol液加入0.2ml的比例加入氯仿,蓋緊離心管,用手劇烈搖蕩離心管15秒;
3、 取上層水相于一新的離心管,按每ml Trizol液加0.5ml異丙醇的比例加入異丙醇,室溫放置10分鐘,12000g離心10分鐘;
4、 棄去上清液,按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇,混勻,4℃下7500g離心5分鐘;
5、 重復第4步;
6、 小心棄去上清液,然后室溫干燥5-10分鐘,注意不要干燥過分,否則會降低RNA的溶解度;
7、 然后將RNA溶于水中,放置10分鐘。 

用TRIzol LS提取
應用TRIzol LS提取病毒RNA
所提取物為血清、血液、細胞培養(yǎng)液、雞胚尿囊液等液體中的病毒。提取時盡量在人少時進行,防止空氣中RNA酶的污染。所用一切物品也應是無RNA酶的。
1.1 在1.5ml的eppendorf管中加入病毒原液500ul,再加入TRIzol LS 500ul,充分混勻,室溫放置10min。
1.2 加入200ul的氯仿,蓋緊離心管蓋,用力震蕩離心管(溶液充分乳化,成乳白狀,無分相現(xiàn)象),室溫放置10min (由于氯仿沸點低、易揮發(fā),振蕩時離心管可能爆開,小心)。
1.3 離心 4℃、13000r/min、15min,取上層液相移入另一管(切忌吸動白色中間相)。
1.4 加入等體積異丙醇,輕輕顛倒離心管充分混勻液體,室溫放置10min。
1.5 離心 4℃、13000r/min、15min,(這時乍一看會發(fā)現(xiàn)管子里好像沒有東西,再仔細看看,會發(fā)現(xiàn)靠近管底的壁上有一星點的白色沉淀物,就是它了)用槍小心吸去所有上清。
1.6 1ml75%乙醇洗一遍,離心 4℃、8000r/min、10min,(這時又會發(fā)現(xiàn)管子沒東西了,不要擔心,有的,但是因為量太少看不見罷了)用槍小心吸去所有上清,在超凈臺中干燥5min。
1.7 加入適量DEPC處理水。(如果材料來源豐富的話,加入的水量為下一步RT的total減去其他試劑的量;若要省著點用,則自己看著辦了,盡量不要加太多的水)。
1.8 建議立即做RT。若要保存,可在上一步加入乙醇后凍存于-70℃,可保存一年;若加入DEPC水后則只能在-20℃保存1個月左右。 

用異硫氰酸胍提取

 

提禽流感病毒的詳細步驟,可參考(我提過N次做定量PCR都沒問題):

 

1.取200ul樣品數+陰性對照+陽性對照個1.5ml滅菌eppendorf管
2.加600ul異硫氰酸胍,然后加入對照和樣品,再加200ul氯仿,顛倒混勻
3.13000rpm離心15min
4.在第3步離心快結束時,另取同樣多eppendorf管,加入400ul -20度預冷的異丙醇
5.取第3步離心的上清(一定不要吸取到中間白色層,第3步離心結束往外拿的時候,管子盡量不要傾斜)轉移到第4步準備的管中,顛倒混勻
6.13000rpm離心15min,輕輕倒去上清;在吸水紙上盡量沾干液體
7.加600ul 75%乙醇,顛倒數次以洗滌殘存異丙醇
7.13000rpm離心15min,輕輕倒去上清;在吸水紙上盡量沾干液體
8.4000rpm離心10sec,將管壁殘存液體甩到底部,用微量槍頭吸干,室溫干燥2-3min(不可過分干燥,防止下一步RNA不溶解)
9.加入20ul DEPE水(加入depc的純水高壓后的水即為DEPE水),輕輕混勻溶解RNA。2000rpm離心5sec,冰上保存?zhèn)溆茫?小時內使用,以免RNA降解) 
[注意] 
1、 整個操作要帶口罩及一次性手套,并盡可能在低溫下操作。
2、 加氯仿前的勻漿液可在-70℃保存一個月以上,RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周,-20℃保存一年

 

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