纖維素酶活力測定實驗原理

纖維素酶是一種多組分酶，包括C1酶、CX酶和β-葡萄糖苷酶三種主要組分。其中C1酶的作用是將天然纖維素水解成無定形纖維素，CX酶的作用是將無定形纖維素繼續(xù)水解成纖維寡糖，β-葡萄糖苷酶的作用是將纖維寡糖水解成葡萄糖。纖維素酶水解纖維素產(chǎn)生的纖維二糖、 葡萄糖等還原糖能將堿性條件下的3,5-二硝基水楊酸（DNS）還原，棕紅色的氨基化合物，在550nm波長處有zui大光吸收，在一定范圍內(nèi)還原糖的量 與反應液的顏色強度呈比例關(guān)系，利用比色法測定其還原糖的量就可測定纖維素酶的活力。 酶活力也稱為酶活性，是指酶催化一定化學反應的能力。酶活力的大小可用在一定條件下，酶催化某一化學反應的速度來表示，酶催化反應速度愈大，酶活力愈高， 反之活力愈低。測定酶活力實際就是測定酶促反應的速度。酶促反應速度可用單位時間內(nèi)、單位體積中底物的減少量或產(chǎn)物的增加量來表示。在一般的酶促反應體系 中，底物往往是過量的，測定初速度時，底物減少量占總量的極少部分，不易準確檢測，而產(chǎn)物則是從無到有，只要測定方法靈敏，就可準確測定。因此一般以測定 產(chǎn)物的增量來表示酶促反應速度較為合適。　　

纖維素酶活力測試探討

1 實驗方法
1．1 試驗藥品、設(shè)備
纖維素酶（DH一8405，DM一8637，德美化工），DNS試劑，冰醋酸，醋酸鈉，葡萄糖（分析純），濾紙（定性），羧甲基纖維素酶CMC（試劑 級），純棉針織半漂布 SPECT0RPH0T0METER VIS一723型分光光度計（上海精密科學儀器有限公司）；HB一4CF型高溫試色機（XIAMEN RAPID CO．，LTD）。
1．2 試驗方法
1．2．1 酶活力測定方法
本實驗中酶活力的定義為1 gN體酶f或1 rnl液體酶），在50 度，pH=4．5條件下，1 h水解底物產(chǎn)生相當于1 mg葡萄糖的還原糖量為1個酶活力單位．以 u／g表示。
取適當酶液．分別以濾紙或CMC溶液為底物．于50℃ 恒溫水解反應．然后加入顯色劑DNS．沸水浴煮沸，加入蒸餾水，在540 nm測定吸光度值。
1．2．2 纖維素酶應用工藝和效果評定
纖維素酶用量為1．5 g／L，NN55 ℃ ，調(diào)節(jié)pH= 4．5，浴比1：10，處理時間45 min，得出減量率。將酶處理前后的試樣在105℃ 烘箱中烘至恒重。
其中減量率=[處理前織物干重一處理后織物干重）／處理前織物干重]xl00％
2 結(jié)果與討論
2．1 稀釋倍數(shù)影響（濾紙法）
DH一8405、、DM一8637稀釋倍數(shù)與酶活力的關(guān)系見表1、表2。

如以酶活力為y軸，以稀釋倍數(shù)為X軸作圖，所得曲線的擬合一元線性回歸方程為y=1．1226x+ 3422，R2=0．9890。

同樣好作酶活力（v）與稀釋倍數(shù)（x）的關(guān)系曲線．其擬合一元線性回歸方程為v=0．5023x+853．65， R2==0982。
由以上結(jié)果可知．稀釋倍數(shù)的改變會明顯改變酶活力測定的結(jié)果。在一定范圍內(nèi)稀釋度大．酶活力結(jié)果偏高．稀釋度小．結(jié)果偏低．但是稀釋度過大．結(jié)果也有所降 低：另外．參考各類纖維素酶活力測定方法．用不同稀釋度的酶液對酶活力擬合一元線性回歸方程．可看出該線性相關(guān)區(qū)域較窄．且對于不同的酶存在不同的線性關(guān) 系．在此線性范圍內(nèi)．由任一稀釋酶液得到的結(jié)果都可以推算得到酶液活力。當然這樣給測試帶來很多不便．平常測試中也可以規(guī)定吸光度的范圍．如以吸光度值 0．5左右酶活力定為100％．可看出在此值左右所測酶活力波動不大．相對較穩(wěn)定。

2．2 底物選擇影晌
濾紙作為底物結(jié)構(gòu)較為松散．可及區(qū)較多．是聚合度和結(jié)晶度都居中等的纖維性材料．容易同時被內(nèi)切酶和外切酶降解．再由葡萄糖苷酶分解成葡萄糖等還原糖，反 映的是纖維素酶三類酶組分的協(xié)同作用的總酶活：另外由于外切酶對纖維素鏈的專一性高，而內(nèi)切酶的專一性較低．在降解CMC時．主要反映的是內(nèi)切酶的活力 因此．酶對不同底物的活性是不同的．同一酶活測定方法獲得的幾種酶制劑的活力數(shù)值．在作用其它底物時僅能作為參考。本實驗中選用了濾紙和CMC兩種底物． 對DH一8405、DM一8637NJ種酶進行活力測試，其結(jié)果如表3
 
由3表可知，以CMC為底物測得的酶活力值比以濾紙為底物測得的酶活值高，即兩種酶的內(nèi)切酶活力較高．且比總酶活還大，幾乎差一個數(shù)量級。可能是由于 CMC為水溶性底物，而濾紙與酶屬多相催化，所以反應的空問阻礙較大．也說明了吸附對酶的活性部位與纖維素的結(jié)合及催化均有很大影響。
纖維素酶的3組分．每種酶對纖維素的作用部位都不同．相互之間有協(xié)同性，即使是單一的酶對不同底物的活性也是不同的．同一酶活測定方法獲得的幾種酶制劑的活力數(shù)值．在作用其它底物時僅能作為參考。
2.3 酶活力與減量率關(guān)系
分別用DH一8405和DM一8637對白布進行食毛整理．得出平均減量率比值與酶活力之間關(guān)系．結(jié)果如表4所示。

表4可明顯看出織物的減量率與內(nèi)切酶活力關(guān)系密切。說明織物的酶減量率受內(nèi)切酶活力影響較大。
3 結(jié)論
（1）以濾紙為底物．用不同稀釋度的酶液對酶活力擬合一元線性回歸方程．可看出兩者之間存在較窄的線性關(guān)系，在此線性范圍內(nèi)由任一稀釋酶液得到的結(jié)果都可以推算得到酶液活力．但各種酶其線性關(guān)系是不同的，在實際中為測試方便也可規(guī)定吸光度的范圍．減少酶活力測試誤差。
（2）底物不同，活力的測定值也不同．以羧甲基纖維素為底物測得的CMC酶活值比以濾紙為底物測得的FPA酶活值高；說明酶對水溶性底物有較高的活力；另外根據(jù)酶食毛效果看．CMC酶活更接近實際應用效果。

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