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細(xì)胞DNA轉(zhuǎn)染方法

更新時(shí)間:2013-06-06   點(diǎn)擊次數(shù):2357次

                            細(xì)胞DNA轉(zhuǎn)染方法

 
對(duì)于大部分細(xì)胞系 DNA與DNAfect的比例在1:21:3時(shí)轉(zhuǎn)染效率較高。為了提轉(zhuǎn)化效率、達(dá)水平并少細(xì)胞毒性,實(shí)驗(yàn)應(yīng)在細(xì)胞密度較大時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。以下操作以24孔板每孔細(xì)胞的DNA轉(zhuǎn)染操作為例。
1.      貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)化前一天在24孔板的每孔中加入500 μl無(wú)抗生素的生長(zhǎng)培養(yǎng)基,并于每孔中接種0.5-2×105個(gè)細(xì)胞,待細(xì)胞長(zhǎng)至80-90%滿時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
懸浮細(xì):在細(xì)胞轉(zhuǎn)之前,在24板的每孔加入500  μl無(wú)抗生素的生長(zhǎng)養(yǎng)基,并孔中接種3-5×105
個(gè)細(xì)胞。
2.      轉(zhuǎn)染當(dāng)天,首先準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染復(fù)合物,對(duì)于每孔細(xì)胞按照以下用量配制:
a.  取適量DNA,加入25 μl無(wú)血清培養(yǎng)基,并輕輕的混合均勻。
b.  取適量DNAfect,加入25 μl無(wú)血清培養(yǎng)基,輕輕混勻,并于室溫孵育5分鐘。
c.  孵育5分鐘之后,將稀的DNA和稀的DNAfect合(使DNA及DNAfectin的終總體積為50  μl),輕輕 混合均勻,并在室溫下孵育20分鐘(溶液可能會(huì)出現(xiàn)絮狀,但不會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率) 注意:該混合物在室溫下可以穩(wěn)定保存6小時(shí)。
3.      將步驟1中24孔板中培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基更換成450 μl無(wú)血清培養(yǎng)基,然后將步驟2中50 μl轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到
24細(xì)胞孔板內(nèi),輕輕前后推動(dòng)24孔板以混勻。
4.      將細(xì)胞置于含5%CO2,37條件下培養(yǎng)4-6小時(shí)后,更換成500  μl生長(zhǎng)培養(yǎng)基。
5.      18-48小時(shí)后進(jìn)行轉(zhuǎn)染基因表達(dá)的檢測(cè)。
6.      對(duì)于穩(wěn)定的細(xì)胞系:在轉(zhuǎn)染24小時(shí)后,細(xì)胞按照1:10的比例傳代,第二天可加入篩選培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。
(1)  該說(shuō)明一個(gè)24孔的用量若同時(shí)轉(zhuǎn)幾個(gè)孔,配制轉(zhuǎn)染復(fù)合物的量需加倍若轉(zhuǎn)染其他類(lèi)型孔板,DNA和DNAfect見(jiàn)附表,該附表用量以293T細(xì)胞為轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)用量。
(2)  轉(zhuǎn)染4-6小時(shí)后可以不更換長(zhǎng)養(yǎng)基,但由于DNAfect具有細(xì)胞毒性,時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能使細(xì)胞出現(xiàn)大死亡現(xiàn) 象,建議更換生長(zhǎng)培養(yǎng)基。
(3)  優(yōu)化條件:想要得到更高的轉(zhuǎn)效率,應(yīng)優(yōu)化轉(zhuǎn)條件:培養(yǎng)物、DNA濃度、細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞與DNA復(fù)合物的孵育時(shí)間條件都 應(yīng)進(jìn)行優(yōu)化。

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