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技術(shù)推廣抗體純化的檢測(cè)方法

更新時(shí)間:2013-08-05   點(diǎn)擊次數(shù):1467次
    純化抗體通常用于直接檢測(cè)抗原。此時(shí)抗體標(biāo)記有一個(gè)易于鑒定的標(biāo)記物,用于結(jié)合和檢測(cè)所研究的抗原。在間接檢測(cè)抗原方法中,一抗不被標(biāo)記,而是用標(biāo)記的二抗(一種抗免疫球蛋白抗體)來檢測(cè)。一般而言,建議使用間接法。因?yàn)樵S多商家能夠提供可靠的標(biāo)記二抗,用間接法不僅省力,結(jié)果同樣可靠。
    盡管如此,有幾種方法需要標(biāo)記的一級(jí)抗體。例如,在免疫染色試驗(yàn)中,需要研究2個(gè)或2個(gè)以上抗原的相對(duì)位置時(shí),常需要純化抗體并用不同標(biāo)記物標(biāo)記,這樣能比較它們的相對(duì)位置。此時(shí)使用間接法不合適。因?yàn)殚g接法是用標(biāo)記二抗來給未標(biāo)記的一抗定位。又如,有時(shí)一抗需要標(biāo)記,而該樣本中又有大量無關(guān)抗體,它們能干擾對(duì)一抗的檢測(cè),此時(shí)用間接法也不合適。用鼠源性單抗對(duì)鼠組織抗原進(jìn)行定位時(shí),也會(huì)出現(xiàn)這種情況。此時(shí)需要純化一抗,并直接按下述方法進(jìn)行標(biāo)記。
    免疫親和純化是另一種可能需要純化抗體的技術(shù)。在這一技術(shù)中,抗體共價(jià)交聯(lián)到一固相基質(zhì)上,如交連的瓊脂糖或聚丙烯酰胺微球。常用的方法是,先將抗體純化,然后連接到通過化學(xué)方法激活而具有結(jié)合位點(diǎn)的微球上。此時(shí),抗體的純化對(duì)實(shí)驗(yàn)的成功至關(guān)重要。
    還有一種需要純化抗體的試驗(yàn),是從多克隆抗血清中分離抗原特異性抗體。多克隆血清中含有復(fù)雜多樣的抗體,它不僅含有針對(duì)免疫原產(chǎn)生的抗體,還有血清的全部抗體。出于特定目的的需要,必須將抗原的特異性抗體分離出來。例如使用抗肽抗體時(shí),需要分離出特異性識(shí)別肽段的抗體。通過純化能獲得特異性很高的抗體。純化抗體的另一用途是降低本底。幾乎在所有技術(shù)中,使用純化抗體都能降低非特異性本底。產(chǎn)生這種效果主要是因?yàn)橐环矫婺苋コ饘?shí)驗(yàn)誤差的污染蛋白,另一方面能控制實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生陽性信號(hào)的抗體量。使用純化抗體不會(huì)使本底增加,因此純化抗體可以作為所有免疫化學(xué)實(shí)驗(yàn)中降低本底的基本手段。
    抗體的純化通常是濃縮抗體的zui簡(jiǎn)單方法。任何來源的抗體可以用蛋白A或蛋白G的純化方法來濃縮。
    盡管純化抗體的方法較多,建議用蛋白A或蛋白G微球純化法作為zui常用的方法。這種方法效率高,能為常用的實(shí)驗(yàn)方法提供足夠純化的抗體,而且隨著商品化的蛋白A和蛋白G基質(zhì)的出現(xiàn),能將任何來源的抗體純化??贵w的純化也可采用傳統(tǒng)的色譜法,在某些情況下非常有用。這些方法包括DEAE離子交換色譜法、硫酸銨沉淀法及其他方法。但是用蛋白G或蛋白A親和柱法純化較其他方法簡(jiǎn)單,并且純化效果是其他方法的數(shù)倍。因此在所有方法中,我們推薦這種方法。
    有一種情況不適于應(yīng)用蛋白G或蛋白A親和柱純化抗體,即多克隆抗體需要進(jìn)一步分離,且針對(duì)某種特異性抗原的組分需要分離。此時(shí)可用抗原結(jié)合的親和柱純化抗原特異性抗體。這一特殊的純化方法,將在后面討論。

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