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羥脯氨酸(Hyp)檢測(cè)原理說明

更新時(shí)間:2015-06-03   點(diǎn)擊次數(shù):2234次

               羥脯氨酸(Hyp)檢測(cè)原理說明

(               測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞,培養(yǎng)液)



一、原理 羥脯氨酸在氧化劑的作用下所產(chǎn)生的氧化產(chǎn)物與二甲氨基苯甲醛作用呈現(xiàn)紫紅色,

根據(jù)其呈色的深淺可推算出其含量。 二、試劑盒組成與配制:

1、試劑一:粉劑×2 瓶,甲 10ml×2 瓶,乙 20ml×2 瓶,臨用時(shí)取粉劑一瓶,先加 甲液混勻 10ml 分溶解(從瓶口向內(nèi)看,*溶解完)。然后再加乙液 20ml 充分混勻。配好后的試劑 4~8冰箱保存。

注意點(diǎn):粉劑加甲液 10ml 后一定一定要*溶解后才能加乙液。

2、試劑二:液體 60ml×1 瓶,4冰箱避光保存。

3、劑三:粉劑×1 , 60ml×1 瓶,臨用時(shí)將粉劑一支加到 60ml 劑中充分溶解, 配好后 4℃避光保存。

4、試劑四:羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品 5mg×3 支,4冰箱保存。

標(biāo)準(zhǔn)貯備液的配制:測(cè)試前將一支標(biāo)準(zhǔn)品用蒸餾水溶解后定溶至 50ml100μg/ml 標(biāo)準(zhǔn)貯備 液。

2μg/ml 標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液的配制:取 100μg/ml 標(biāo)準(zhǔn)貯備液 0.2ml 蒸餾水定溶至 10ml配成 2μg/ml

的標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液,現(xiàn)用現(xiàn)配。

5、消化液:劑×1 瓶,溶 3ml×1 瓶,4冰箱保存。用前將粉劑倒入溶劑中,并 用溶劑將粉劑瓶洗干凈,現(xiàn)用現(xiàn)配。

*注意:混勻時(shí)用雙手小心旋動(dòng)小瓶,切勿上下顛倒混勻,以免引起大量氣泡。

三、操作步驟:

1、樣本前處理:(血清及體液可直接進(jìn)行檢測(cè),組織則需制成勻漿后檢測(cè)。) 組織塊稱重,放在勻漿管口部,用小剪刀剪碎,加入 9 生理鹽水沖入勻稱管

中,緩上下旋轉(zhuǎn)研磨每次半分鐘,隔半分鐘,反復(fù) 5 次或者勻漿機(jī),勻漿時(shí)

10 / 30 ,續(xù) 3~5 進(jìn)行。漿 3500 轉(zhuǎn)/ 10 , 取上清 0.1ml 0.4ml 鹽水,稀釋 2%織勻漿進(jìn)行測(cè), 0.05ml 10%勻 漿加生理鹽水 0.45ml 制備成 1%勻漿,請(qǐng)做預(yù)試后再確定勻漿濃度。(詳見實(shí)驗(yàn)方法學(xué))。

2、消化




空白管

標(biāo)準(zhǔn)管

測(cè)定管

雙蒸水(ml

0.25



2μg/ml 標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液

ml


0.25


檢測(cè)液(ml



0.25

消化液(ml

0.05

0.05

0.05



3、羥脯氨酸測(cè)定:


混勻,37℃水浴 3 小時(shí)



試劑一(ml

0.5

0.5

0.5


混勻,室溫靜置 10 分鐘



試劑二(ml

0.5

0.5

0.5

混勻,室溫靜置 5 分鐘


試劑三(ml

1.0

1.0

1.0

勻,60℃水 15 鐘,流水冷卻后,3500 轉(zhuǎn)/離心 10 鐘,取上清(注

意不要混入下面沉淀)在 550nm 處,1cm 光徑,蒸餾水調(diào)零,測(cè)各管吸光度。

注意:若您的樣本中所含羥脯氨酸過低,可以增加您的樣本取樣量或增加勻漿濃度。

4、蛋白定量。

四、計(jì)算與舉例:

1、公式

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