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恒遠(yuǎn)分享:細(xì)胞冷凍保存法及解凍培養(yǎng)技巧

更新時(shí)間:2017-07-14   點(diǎn)擊次數(shù):2763次

     培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)為防止以下問題,細(xì)胞將做冷凍保存:*、株化細(xì)胞產(chǎn)生性狀轉(zhuǎn)變。第二、污染。第三、株化細(xì)胞之增殖或生理特性有特定之限制,只能在一定的代數(shù)范圍內(nèi)進(jìn)行增殖培養(yǎng)或進(jìn)行特定實(shí)驗(yàn)。目前可能解決這些困難的方法其中之一是細(xì)胞冷凍保存法,將冷凍細(xì)胞儲(chǔ)于冷凍管中,將其中一部分拿出來做一些必要的檢查,其它的冷凍細(xì)胞則在需要時(shí)拿出來解凍,用來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本方法亦可節(jié)省繼代培養(yǎng)時(shí)所花費(fèi)的勞力、物力,并可防止培養(yǎng)中經(jīng)常發(fā)生意外事故,喪失細(xì)胞珠。因此冷凍保存法為研究上之基本技術(shù)之一。

說明 :

1.經(jīng)過冷凍保存后的細(xì)胞,其生存率會(huì)下降,冷凍時(shí)之冷卻速度,保存溫度,解凍時(shí)升高溫度的速度以及添加之冷凍保存液之種類、濃度等都可影響細(xì)胞存活率。
2. 一般而言,4℃以下慢慢地冷凍,保存于液態(tài)氮中(-196℃)。
3. 37℃快速解凍。
4.保護(hù)劑(抗凍劑):添加甘油 (glycerol) ( I0 %左右 ) 或dimethy1sulfoxide (DMSO) ( 5- 10% ) 。
5.有些細(xì)胞如果采用上述的方法時(shí),無法得到高的存活率。此時(shí),則必需考慮可能傷害細(xì)胞的機(jī)制,添加劑之作用等而來找出適當(dāng)?shù)臈l件來修正。

材料 :
1.增殖期之細(xì)胞 (9成滿),培養(yǎng)于培養(yǎng)皿中數(shù)個(gè)。
2.冷凍用培養(yǎng)基(2倍) : 培養(yǎng)基內(nèi)加入三倍血清及15% DMSO,保存在冰箱中。
3. 冷凍管、保利龍制容器、鋁制ample支持棒。

步驟:
1.準(zhǔn)備2 x 107cells/ml的細(xì)胞懸浮液。
2.冷凍用培養(yǎng)基(2倍) :以微溫水溶解DMSO,在培養(yǎng)基中混合為15% (v/v)。這是DMSO的二倍濃度之溶液。必須在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前在行配制,配好后放在冰箱中,使用量必須和細(xì)胞懸浮液的量相等;使用時(shí)維持在4℃。
3.分裝: 在冷凍管管中分別加0.5ml (1/2冷凍管體積)冷凍用培養(yǎng)基(2倍)及2 x 10(7次方)cells/ml的細(xì)胞懸浮液;等量混合。將蓋子扭緊后,在管中部貼上膠帶密封。
4.記載卷標(biāo) : 用抗凍marker pen在冷凍管上寫明細(xì)胞名稱、代數(shù)、冷凍的年,月,日等所需要的項(xiàng)目。
5.放進(jìn)冷卻的保利龍容器中,而在- 80℃的超低溫槽中放置一個(gè)晚上。
6.放進(jìn)液態(tài)氮容器中及保存 : 在支持棒上裝上冷凍管,迅速地放進(jìn)容器內(nèi)。

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