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恒遠(yuǎn)教你生物素標(biāo)記蛋白操作的方法

更新時(shí)間:2020-08-19   點(diǎn)擊次數(shù):1204次

下面的操作方法可以使約3~5分子的生物素與1分子的蛋白結(jié)合,對(duì)某些蛋白來(lái)說(shuō),生物素與蛋白的分子比可根據(jù)不同的生物素化要求進(jìn)行調(diào)整。

1. 溶解2~10 mg 蛋白于1 ml 的BuphTm磷酸鹽緩沖液中,并計(jì)算溶解的毫摩爾數(shù)。如果蛋白含有不恰當(dāng)?shù)木彌_液(如Tris或者甘氨酸),可以通過(guò)在PBS中透析或濃縮的方法除去。計(jì)算:蛋白質(zhì)量(mg)/蛋白分子量(MW)=蛋白質(zhì)的毫摩爾數(shù)。

2. 在打開(kāi)之前,平衡生物素至室溫。加2 mg Sulfo-NHS-Biotin于100 ul 超純水中,加入足夠量濃度的生物素,一般對(duì)于10 mg/ml 蛋白來(lái)說(shuō)超過(guò)12倍分子數(shù),對(duì)于2 mg/ml 蛋白溶液應(yīng)超過(guò)20倍,或者該試劑也可以直接以粉末的形式加入蛋白溶液中。

3. 室溫30分鐘,或冰上放置2小時(shí)。

4. 用30 ml PBS預(yù)洗純化柱,上樣,加入與欲收集量相同的緩沖液,收集0.5 ml 或1 ml 于單獨(dú)的管中。

5. 以280 nm 的吸收值測(cè)定蛋白含量。

6. 生物素化的蛋白4℃存放至使用,可加入疊氮鈉、甘油等保存。

HABA法檢測(cè)生物素標(biāo)記效果:

試劑配制:
1. PBS(100 mM 磷酸鹽,150 mM Nacl pH7.2)。
2. HABA/親和素溶液:10 mg 親和素、600 ul10 mM HABA于19.4 ml 的PBS中,該溶液的A500大約在0.9~1.3之間,溶液于4℃保存可穩(wěn)定2周。如果有沉淀形成(HABA溶液)可過(guò)濾后使用。

比色法檢測(cè)生物素/蛋白質(zhì)摩爾質(zhì)量比:
1. 吸取900 ul HABA/親和素溶液于1ml比色杯。
2. 測(cè)定該溶液在500 nm 處的吸收值并記錄為“A500 HABA/Avidin”。
3. 吸取100 ul 生物素標(biāo)記的蛋白于杯中并測(cè)定500 nm 的吸光度值,記為A500 HABA/Avidin/Biotin (數(shù)值必須恒定15s 以上)如果A500 HABA/Avidin/Biotin的值不超過(guò)(≤)0.3,重新稀釋待測(cè)樣品并檢測(cè)。
注:計(jì)算結(jié)果時(shí)必須考慮稀釋度。
4. 計(jì)算Biotin/Protein摩爾比
①A=生物素化的蛋白毫摩爾濃度=蛋白濃度(mg/ml)/蛋白的分子量
②B=500nm處的吸光度變化(△A500=(0.9×A500HABA/Avidin)-A500HABA/Avidin/Biotin)
③C=生物素的毫摩爾濃度=mmol Biotin/ml反應(yīng)溶液=△A500/(34,000×光程)
④Biotin/Protein摩爾比=C?10?稀釋倍數(shù)/

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