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你們了解雙抗夾心ELISA法嗎?

更新時(shí)間:2022-10-10   點(diǎn)擊次數(shù):830次

雙抗夾心ELISA法是指講特異性針對(duì)代測(cè)抗原的抗體包被于96孔微孔板中,制成固體載體,向微孔中分別加入標(biāo)準(zhǔn)品或標(biāo)本,其中代測(cè)抗原連接于固相載體的抗體結(jié)合,然后加入生物素化的針對(duì)代測(cè)抗原的抗體,形成夾心,將未結(jié)合的生物素化抗體洗凈后,加入HRP標(biāo)記的親和素,再次*洗滌后加入TMB底物顯色。TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下,轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的待測(cè)抗體原正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(O.D.值),用于樣本中待測(cè)抗原濃度測(cè)算。

 

1.材料與儀器

1) 包被緩沖液 (pH 9.6 0.05 M 碳酸鹽緩沖液)

2)洗滌緩沖液 (pH 7.40.15 M PBS

3)稀釋液

4)終止液(2 M H2SO4

5)底物緩沖液 (pH 5.0

6)四甲基聯(lián)苯胺(TMB)使用液

72,2’-連氮基--3-乙基-苯丙噻唑啉磺胺(ABTS)使用液

8)抗原、抗體和酶標(biāo)記抗體:按說(shuō)明書(shū)處理。

9)標(biāo)準(zhǔn)品:用稀釋液稀釋成梯度濃度溶液。

1096 孔聚苯乙烯塑料板 (酶標(biāo)板)。

 

2.步驟

將特異性抗體與固相載體連接,形成固相抗體:洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。

 

加受檢標(biāo)本:使之與固相抗體接觸反應(yīng)一段時(shí)間,讓標(biāo)本中的抗原與固相載體上的抗體結(jié)合,形成固相抗原復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì)。

 

加酶標(biāo)抗體:使固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合。*洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。此時(shí)固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量正相關(guān)。

 

加底物:夾心式復(fù)合物中的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量。

 

根據(jù)同樣原理,將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標(biāo)抗原結(jié)合物,即可用雙抗原夾心法測(cè)定標(biāo)本中的抗體。

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