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植物羥基肉桂?;D(zhuǎn)移酶(HCT)ELISA實(shí)驗(yàn)說明

更新時(shí)間:2024-08-05   點(diǎn)擊次數(shù):1162次

檢測范圍:


5U/L -180U/L


使用目的:


本試劑盒用于測定植物組織,細(xì)胞及其它相關(guān)樣本中羥基肉桂酰基轉(zhuǎn)移酶(HCT) 活性。


實(shí)驗(yàn)原理


本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標(biāo)本中植物羥基肉桂?;D(zhuǎn)移酶(HCT)水平。用純化的植物羥基肉桂?;D(zhuǎn)移酶(HCT)抗體包被微孔板,制成固相抗體,往包被單抗的微孔中依次加入植物羥基肉桂?;D(zhuǎn)移酶(HCT),再與HRP標(biāo)記的羥基肉桂?;D(zhuǎn)移酶(HCT)抗體結(jié)合,形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物,經(jīng)過徹che底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的植物羥基肉桂?;D(zhuǎn)移酶(HCT)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度(OD值),通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中植物羥基肉桂?;D(zhuǎn)移酶(HCT) 活性濃度。 


標(biāo)本要求 


1.標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取,提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行,提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn),可將標(biāo)本放于-20℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融


2.不能檢測含NaN3的樣品,因NaN3抑制辣根過氧化物酶的(HRP)活性。


操作步驟


1.標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋:本試劑盒提供原倍標(biāo)準(zhǔn)品一支,用戶可按照下列圖表在小試管中進(jìn)行稀釋。

160U/L5號標(biāo)準(zhǔn)品150μl的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

80 U/L4號標(biāo)準(zhǔn)品150μl的5號標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

40 U/L3號標(biāo)準(zhǔn)品150μl的4號標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

20U/L2號標(biāo)準(zhǔn)品150μl的3號標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

10U/L1號標(biāo)準(zhǔn)品150μl的2號標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液


2.加樣:分別設(shè)空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑,其余各步操作相同)、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣50μl,待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl,然后再加待測樣品10μl(樣品最終稀釋度為5倍)。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動(dòng)混勻。


3.溫育:用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。   


4.配液:將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用


5.洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30秒后棄去,如此重復(fù)5次,拍干。


6.加酶:每孔加入酶標(biāo)試劑50μl,空白孔除外。 


7.溫育:操作同3。


8.洗滌:操作同5。


9.顯色:每孔先加入顯色劑A50μl,再加入顯色劑B50μl,輕輕震蕩混勻,37℃避光顯色10分鐘.


10.終止:每孔加終止液50μl,終止反應(yīng)(此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。


11.測定:以空白孔調(diào)零,450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。 測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。


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