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考馬斯亮藍G-250染色法測定蛋白含量

更新時間:2012-10-26   點擊次數(shù):5158次

 考馬斯亮藍G-250染色法測定蛋白含量 

1、實驗?zāi)康模?/span>掌握考馬斯亮藍G250染色法測定蛋白含量的原理和方法。

2、實驗內(nèi)容

實驗原理:考馬斯亮藍G-250染料,在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合,使染料的zui大吸收峰的位置(λmax),由465 nm變?yōu)?/span>595 nm,溶液的顏色由棕黑色變?yōu)樗{色。經(jīng)研究認為,染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸(特別色精氨酸)和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。在595 nm下測得的吸光度A595 nm,與蛋白質(zhì)濃度成正比。

試劑與材料:

1. 標準蛋白質(zhì)溶液

稱取牛血清白蛋白(BSA10mg,溶于100ml水,配置成100μg/ml的標準蛋白質(zhì)溶液。

2. 考馬斯亮藍G-250染料試劑

100 mg考馬斯亮藍G-250溶于50 ml95%的乙醇后,再加入120 ml85%的磷酸,用水稀釋至1 L。

3. 材料:豆芽

操作步驟:

1標準曲線的繪制

取試管6支按下表操作,搖勻,25 min后比色(595 nm),1管為空白對照管。作吸光度-蛋白濃度曲線。

1

2

3

4

5

6

1.0 mg/ml標準蛋白質(zhì)(ml

0

0.20

0.40

0.60

0.20

0

蒸餾水(ml

1.00

0.80

0.60

0.40

0.80

1.00

考馬斯亮藍G-250染料(ml

5

2樣品蛋白濃度測定

準確稱取豆芽1.0000g,加入用10mL研磨成勻漿后,5000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘,將上清液轉(zhuǎn)入小燒杯中。

準確吸取樣品上清液1 ml置干凈試管中,加入考馬斯亮藍G-250染料5 ml并搖勻,25 min后比色(595 nm)。對照標準曲線求出樣品蛋白濃度。

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