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真菌菌絲的總RNA的提取

更新時間:2012-10-29   點擊次數(shù):2457次

 真菌菌絲的總RNA的提取

試劑:

RNA 提取緩沖液(CTAB):2% CTAB(W/V),2% 聚乙烯吡咯烷酮PVP(W/V),100 mM Tris-HCl(pH8.0,DEPC處理的水配置),25mM EDTA, 0.5g/L 亞精胺Spermidine,2.0M NaCl,2%巰基乙醇(V/V,使用前加入)。由于在高溫滅菌條件下,Tris-HCl要和DEPC發(fā)生反應(yīng),所以配RNA提取緩沖液時直接用DEPC 處理的水配制即可。

SSTE:1 M NaCl,0.5% SDS(W/V),10 mM Tris-HCl pH8.0,1.0 mM EDTA

10M LiCl 直接用蒸餾水配10M LiCl,加1‰的DEPC過夜后,高溫滅菌。

3M NaAc

氯仿:異戊醇(24:1)

酚(pH4.5):氯仿:異戊醇(25:24:1)

DEPC處理水 用1‰的DEPC處理蒸餾水過夜,高溫滅菌

無水乙醇

70%酒精

方法

1. 實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇)(10mL加80ul,50mL中加入300ul)。

2.取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可!固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50 mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻。

3. 65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

4. 加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5):氯仿:異戊醇(25:24:1)抽提(10,000 rpm,4℃,5 min)

5. 取上清,等體積的氯仿:異戊醇(24:1)抽提(10,000 rpm,4℃,5 min)

6. 加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6hr以上(或過夜)

7. 10,000 rpm,4℃離心20 min

8. 棄上清,用500 ulSSTE溶解沉淀

9. 酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)抽提兩次,氯仿:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000 rpm,4℃,5 min)

10. 加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30 min以上

11. 12,000 rpm,4℃離心20 min

12. 棄上清。沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

13. 加200 ul的DEPC處理水溶解

14. 用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質(zhì)量
      (在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))
      注意:提取RNA請盡量在低溫下操作,如果條件不容許,在室溫下操作的時間要盡可能的短。

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