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甲狀腺過氧化物酶TPO正確檢測方法

更新時間:2013-05-09   點(diǎn)擊次數(shù):1728次

 

甲狀腺過氧化物酶TPO正確檢測方法
 
    甲狀腺過氧化物酶(thyroidperoxidase,TPO)是甲狀腺微粒體(TM)的主要有效抗原活性成分,分子量為84~105kD,基因重組TPO為933個氨基酸的多肽鏈。鑒于以往使用的粗提TM抗原中混雜有其他抗原成分,在測定自身免疫性甲狀腺炎病人血清中抗-TM時,可能出現(xiàn)少數(shù)假陽性,為使結(jié)果更為可靠,目前國外已將抗-TPO代替抗-TM抗體檢測,而且大多數(shù)文獻(xiàn)已將抗-TM抗體改名為抗-TPO抗體。我國徐榮桂等首先建立了純化TPO抗原和測定抗-TPO抗體的ELISA方法。其TPO抗原分析與國外文獻(xiàn)報告相似。抗-TPO抗體的陽性率在各組疾病中,與抗-TM抗體有一定相關(guān)性(r二0.731),且低于抗-TM陽性率,與國外所得的結(jié)果也相近(r二0.584—0.835)。故介紹如下。
 
    1.TPO抗原的制備:取單純性甲狀腺腫手術(shù)切除物10g,冰凍后切成小塊,加40mL0.05mol/L,pH 7.0PBS(含200btmol/LKl)。用組織搗碎機(jī)10000r/min破碎2min,再用超聲細(xì)胞粉碎儀粉碎3rnin。其勻漿經(jīng)紗布過濾。1 000r/rain離心10min,上清用35 000Xg離心45min(4℃),沉淀物用上述PBS洗3次,將沉淀物再溶于2mLPBS中,然后加20mLl0%去氧膽酸鈉和20mL 0.14~/,胰酶,室溫作用1h,立即離心10 000 X g 20rain(4℃),過SephadexG-200凝膠柱,同上PBS洗脫。收集主峰蛋白,PBS透析后再用抗人全血清Sevharose4B親和層析柱吸收,—20cC保存?zhèn)溆谩?/span>
 
    2.操作步驟  用TPO抗原5Ug/mL(用0.1mmol/LpH9.6碳酸鹽緩沖液稀釋)100gL包被聚苯乙烯反應(yīng)板微孔,4℃過夜;洗滌后,加1:10稀釋(用含10%小牛血清PBS)的病人血清100r&,同時設(shè)陰、陽性對照孔,45℃1h;洗板后加100tzLl:10 000HRP-SPA,45℃,1h;洗板4次后,用OPD底物顯色10rain,以2mol/LU2S04終止反應(yīng);在酶標(biāo)儀測492nm吸光度。陽性:P/N值大于或等于2.1。
 
    3.臨床意義  甲亢和橋本甲狀腺炎患者血清抗-TIAO的陽性率分別為42.2%和77.7%,與國內(nèi)外文獻(xiàn)報道接近。且類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者陽性率(3.1%)比國外的檢測結(jié)果低。目前國內(nèi)常用TGA及抗-TPO聯(lián)合檢測作為臨床診斷和鑒別診斷自身免疫性甲狀腺炎的重要依據(jù)。

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