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那些個步驟詳解,恒遠實驗“單雙”酶切

更新時間:2014-02-20   點擊次數(shù):1935次

    您聽說過酶切技術(shù)嗎?每一種實驗方法技術(shù)都是有它的實驗原理與目的的。那么酶切技術(shù)呢?問題既然是我們提出的,那么就由我們來為您解答。
    酶切可以獲得粘性末端進行連接,它用于驗證DNA重組是否成功,還用于驗證質(zhì)粒酶切位點是否有效。我們下面就來看看那些個步驟詳解,恒遠實驗“單雙”酶切。
實驗之前上海恒遠為您整理出了所需要用到的材料試劑:


    我們把實驗的材料準備好了之后就可以進入實驗的操作過程了,本文的標題中,“單雙”酶切您怎么理解?我們來依次看看。
首先來看單酶切: 
1、我們在在1.5 mL滅菌離心管中依次加入質(zhì)粒DNA:X μL(約1 μg)、限制性內(nèi)切酶:1 μL(約10 U)、10×buffer:2 μL、ddH2O:補足20 μL。
2、混勻,做好標記。
3、37℃水浴1-3 h。
4、70℃水浴10 min中止反應(yīng)。
5、電泳檢測酶切效果。
雙酶切:
1.  在1.5 mL滅菌離心管中依次加入質(zhì)粒DNA:X μL(約1 μg)、限制性內(nèi)切酶1:1 μL(約10 U)、限制性內(nèi)切酶2:1 μL(約10 U)、10×buffer:1或2 μL、ddH2O:補足20 μL。
2、混勻,做好標記。
3、37℃水浴1-3 h。
4、70℃水浴10 min中止反應(yīng)。
5、電泳檢測酶切效果。
    實驗結(jié)束之后要怎么去分析其結(jié)果呢?我們假若一種酶在環(huán)狀質(zhì)粒DNA中只有一個酶切位點, 且酶切*,紫外燈下檢測電泳結(jié)果,則單酶切應(yīng)為一條帶, 而雙酶切則為兩條帶。如果條帶數(shù)目多于理論值,那么有可能是酶切不*。如果酶切結(jié)果與酶切前的質(zhì)粒條帶一樣,比如說超螺旋、線性和開環(huán)三條帶,則說明質(zhì)粒*沒有被切開。
    您在操作實驗的過程中也要注意,您酶切的選擇原則一般是盡量擴大酶切體系,這樣抑制因素得以稀釋;基因組DNA或質(zhì)粒DNA酶的用量較一般DNA大,一般為1μg/10U;所加酶的體積不能超過酶切總體積的1/10,否則甘油濃度會超過5%,會產(chǎn)生星號活力;對難切的質(zhì)?;蚧蚪MDNA應(yīng)延長反應(yīng)時間4―5hr, 甚至過了一個晚上。滅活限制性內(nèi)切酶活性可以采用加熱滅活,乙醇沉淀,酚/氯仿抽提,添加EDTA或SDS等方法,具體每一種酶可能有些方法不能*滅活,這一點需要您多要注意。
    今天的文章到這里就結(jié)束了,實驗中的材料、步驟以及zui后需要注意的事項我們都為您總結(jié)出來了,如果您還有其它實驗、產(chǎn)品、技術(shù)方面的問題都可以我公司的,上海恒遠非常感謝您的支持!

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